20232 Процесс получения зернового сусла и других составляющих для производства спирта
СОДЕРЖАНИЕ
Введение 1. Объекты и методы исследований 2. Анализ и биохимическая характеристика ферментных препаратов 3. Анализ промышленных и новых отселекционированных рас спиртовых дрожжей 4. Испытания биотехнологии интенсивного сбраживания зернового сусла с применением комплексных ферментных препаратов и новых рас дрожжей с термотолерантными и осмофильными свойствами в производственных условиях спиртовых заводов Выводы Литература Приложения
Введение
Как и все отрасли пищевой промышленности, спиртовая отрасль испытывает в настоящее время большие трудности, приводящие к снижению объемов производства продукции, повышению ее себестоимости из-за диспропорции в ценовой политике (рост цен на сырье и электроэнергию намного опережает рост цен на продукцию), трудностей со сбытом продукции, нестабильности работы предприятии. Производственная база спиртовой отрасли насчитывает более 200 заводов, как больших, так и мелких предприятий, обладающих достаточным потенциалом для полного удовлетворения потребностей в пищевом спирте высокого качества. На действующем оборудовании спиртзаводов объем стабильного производства спирта можно довести до 200 млн.дал в год без введения в действие дополнительных мощностей. Однако, за последние 10 лет вследствие сокращения объемов выпуска алкогольной продукции, низкой рентабельности производства значительно понизился уровень технической оснащенности предприятий. Износ основного технологического оборудования большинства спиртзаводов достиг 50% (1). Поэтому необходимо дальнейшее совершенствование технологических процессов, создание новых ресурсосберегающих технологий и оборудования с целью интенсификации спиртового брожения, снижения себестоимости получаемой продукции, сокращения расхода теплоэнергетических ресурсов, максимального использования существующих мощностей спиртового производства, повышения качества и конкурентоспособности продукции на отечественном и мировом рынке (2). Повышение рентабельности пищевых производств возможно при ис-пользовании высокоактивных биологических катализаторов различного спектра действия, технологии применения которых в спиртовом производстве разработаны в нашем институте. Их внедрение на заводах России позволило быстрыми темпами вытеснить солод; высвободить из производства более 200 тысяч тонн высококачественного пищевого зерна; внедрить на 30 заводах отрасли прогрессивные ресурсосберегающие технологии гидродинамической и ферментативной обработки крахмала сырья, что с солодом было практически невозможно. За последние годы значительно изменился состав зернового сырья перерабатываемого на спирт. Наиболее широко распространенными культурами стали рожь, ячмень и зерносмеси с превалирующим количеством в них этих культур. Переработку пшеницы на спирт проводили в ограниченных количествах и преимущественно в южных регионах. Кроме того, изменился и углеводный состав перерабатываемых зерновых культур за счет увеличения в нем доли некрахмалистых полисахаридов. Дефицит зерна, который имел место последние годы, привел к значительному повышению цен на зерно, что негативно сказалось на конкурентоспособности спирта (по цене) по сравнению с им-портируемым из-за рубежа. Наиболее актуальным и перспективным направлением в совершенствовании технологии спирта становится эффективное использование всех высокомолекулярных полимеров зернового сырья с целью его экономии и повышения выхода конечного продукта — спирта. Применение новых ферментных препаратов позволит более рационально использовать компоненты зернового сырья. Анализ патентной и специальной литературы, а также опыта отечест-венной и зарубежной науки и практики показал, что для повышения эффек-тивности биоконверсии трудносбраживаемых видов сырья, таких как рожь и ячмень, необходимо введение в состав ферментного комплекса наряду с традиционно используемыми амилазами бета-глюканаз, ксиланаз, ферментов целлюлолитического и цитолитического действия. С целью повышения бродильной активности дрожжей, улучшения технологических показателей сусла, ускорения процессов дрожжегенерации и брожения — применение комплекса кислых и слабокислых протеаз (3-5). Разрабатываемые научные основы новой технологии будут учитывать состав белковых веществ и некрахмальных соединении различных видов зернового сырья, для повышения эффективности биоконверсии которых планируется применение специально подобранных мультиэнзимных композиций цнлевого назначения. Их использование позволит интенсифицировать процесс спиртового брожения и увеличить выход спирта. Узким местом на спиртовых заводах остается бродильное отделение. Увеличение производительности бродильного отделения путем установки дополнительных бродильных емкостей требует больших капитальных затрат. Повысить эффективность работы бродильного отделения можно как за счет расширения ассортимента используемых ферментов, так и за счет улучшения качества спиртовых дрожжей. Традиционно в спиртовой промышленности применяли одну расу дрожжей, обеспечивающую достаточную скорость брожения и устойчивый выход спирта. Новые направления развития технологии производства спирта ставят такие задачи, как повышение концентрации перерабатываемого сусла, проведение брожения при повышенных температурах и повышенной крепости в бражке, обеспечение дальнейшего сокращения себестоимости спирта за счет экономии сырья, топлива и электроэнергии. В таких условиях нужны расы дрожжей, обладающие осмофильностью, термостабильностью и высокой бродильной активностью. Поэтому селекционные работы по скринингу активных рас дрожжей являются также перспективным направлением совершенствования технологии произ-водства спирта. В настоящее время получены новые высокопродуктивные расы дрожжей, обладающие осмофильностью и термотолерантностью. Эти расы способны сбраживать сусло с концентрацией сухих веществ более 20%, они устойчивы к повышенным температурам брожения и повышенным концентрациям спирта. Внедрение термотолерантных и осмофильных рас дрожжей позволит ускорить процесс брожения, увеличить выход спирта, повысить его качество и снизить потери сырья. В связи со сложившейся большой конкуренцией на рынке алкогольной продукции получение высококачественного спирта является важной задачей. Известно, что существенное влияние на формирование вкуса и аромата спирта оказывают летучие примеси, образующиеся в процессе брожения и не удаленные при ректификации (6). Основными факторами, оказывающими негативное воздействие на органолептические показатели пищевого спирта, являются плохое качество зернового сырья и воды, высокие температурные режимы при водно-тепловой обработке зерна, экстремальные для дрожжей технологические параметры брожения (повышенная температура и концентрация сухих веществ сусла, увеличенные сроки брожения), недостаточное соблюдение микробиологической чистоты процесса. При этом наиболее существенное влияние оказывает качество перерабатываемого сырья. Сорность зерна, содержание токсичных примесей, зараженность вредителями хлебных злаков, излишняя влажность, инфицирование зерна фитопатогенной микрофлорой и эпифитными микроорганизмами (плесневыми грибами, дикими дрожжами и бактериями) все это приводит к повышению образования побочных метаболитов, придающих спирту излишнюю горечь, жесткость и резкость, не характер-ный спирту запах. Кроме того, как на образование летучих примесей, их количество и состав, оказывает также влияние раса используемых дрожжей. Поэтому проведение исследований по применению спиртовых дрожжей нового поколения даст возможность не только интенсифицировать процесс брожения, но и повысить качество спирта. Внедрение результатов научно-исследовательских работ позволит повысить эффективность спиртового производства, ускорить процесс биоконверсии зернового сырья, уменьшить расход электроэнергии, увеличить выход спирта, повысить качество конечного продукта, что обеспечит снижение себестоимости спирта, повышение его конкурентоспособности. Таким образом, анализ современного состояния производства в спиртовой отрасли, проведенный с учетом результатов экспериментальных исследований, достижений зарубежной и отечественной науки и практики позволили определить основные задачи для создания интенсивной технологии получения спирта на основе комплексного использования мультиэнзимных систем целевого назначения и новых рас спиртовых дрожжей с термотолерантными и осмофильными свойствами. Для их реализации необходимо: - провести анализ и исследовать биохимическую характеристику ферментных препаратов различного спектра действия для разжижения и осахаривания крахмала сырья, протеолиза белковых веществ и гидролиза некрахмальных полисахаридов зернового сырья; - провести анализ промышленных и новых отселекционированных рас спиртовых дрожжей; - исследовать уровень бродильной активности отобранных рас дрожжей; - осуществить скрининг дрожжей с термотолерантными и осмофильными свойствами; - изучить влияние температуры, концентрации сухих веществ зернового сусла и спирта на жизнедеятельность дрожжей; - провести производственные испытания по применению новых рас дрожжей для интенсификации процессов дрожжегенерации и спиртового брожения; - разработать Технологическую инструкцию по применению термотолерантной и осмофильной расы дрожжей в спиртовом производстве.
Объекты исследований
Объектами исследований на разных этапах работы являлись ферментные препараты протеолитического, амилолитического и целлюлолитического действия различного микробного происхождения. Всего исследовано 18 образцов. Объектами исследования служили культуры плесневых грибов — продуценты кислых и слабокислых протеаз, и бактерий - продуцентов амилолитических ферментов, имеющиеся????(ихся) в музее чистых культур и отселекционированные???(ых) в отделе биотехнологии ферментных препаратов ВНИИПБТ. Объектами исследований служили различные расы спиртовых дрожжей, выделенные из промышленных культур, а также полученные селекционным путем и из музея чистых культур. Продуценты культивировали глубинным способом на натуральных средах, в состав которых входили различные виды муки и минеральные соли. Количество и состав компонентов зависел от условий экспериментов. Культивирование продуцентов проводили в колбах Эрленмейера объемом 750 мл с 50 мл среды; в полупроизводственных условиях - в ферментаторах объемом 15 дм3 «Биоинжениринг» при степени заполнения 0,5; в производственных условиях - в ферментаторах объемом 20 и 32 м3 с коэффициентами заполнения 0,5 и 0,7 в течение 42 - 72 часов. Методы исследований В работе применены общепринятые и специальные физические, физи-ко-химические, химические, биохимические, микробиологические, хроматографические, газовые и жидкостные, и спектрофотометрические методы анализа. Важной характеристикой любой ферментной системы является уро-вень активности отдельных ферментов комплекса. В настоящем исследовании проводилось определение различных фер-ментативных активностей, позволяющих составить представление о качест-венном и количественном составе того или иного комплекса, а также направленности его действия. Амилолитическая активность Амилолитическую активность определяли общепринятым методом гидролиза крахмала по ГОСТу РФ 20264.4-89 (7). Общая протеолитическая активность Протеолитическая активность характеризует способность фермента катализировать расщепление белков до аминокислот или пептидов. Протеолитическую активность (ПС) определяли модифицированным методом Ансона по гидролизу гемоглобина препаратам фермента с последующей его инактивацией и осаждением непрогидролизованного белка трихлоруксусной кислотой (ТХУ). За единицу активности принимали такое количество фермента, которое за 1 мин при 20°С способствовало образованию 1 мкм тирозина при гидролизе белка (8).
Активности сериновой, карбоисильной и металлопротеиназ, лейцинамино- и карбоксипептидаз измеряли по специфическим субстратам. Для обнаружения возможного вклада в гидролиз субстратов других протеаз комплекса применяли специфические ингибиторы. За единицу активности во всех случаях принимали такое количество фермента, которое в стандартных условиях за 1 мин. расщепляло 1 мкм субстрата. Активность сериновой протеиназы определяли по специфическому субстрату n-нитроанилид бензол-оксикарбонил-L-аланил-K-аланил-L-лей-цину (Z-Ala-Ala-Leu-pNa, завод химреактивов “Олайне“). При определении вклада в гидролиз субстрата других протеолитических ферментов комплекса применяли специфический ингибитор сериновой протеиназы фенилметилсульфонилфторид (PMSF, фирмы “Serva“, ФРГ). Об активности нейтральной металлопротеиназы судили по гидролизу специфического субстрата динитротрофенил-L-глицил-L-глицил-L-изолей-цил-L-аргинина (DNP-Gly-Gly-Ile-Arg), синтезирован Л.А. Люблинской). Активность металлопротеиназы подавляли атилендиаминтетраацетатом (ЭдтА). Наличие активности карбоксильной протеиназы подтверждали с помощью специфического ингибитора пепсина N-диазоацетил-N'-2,4-динитрофенил-этилендиамина (ДДЭ, синтезирован Т.И. Вагановой). Актив-ность нейтральной протеиназы, которая также могла гидролизовать субстрат подавляли CuCl . Остаточную активность определяли по методу Ансона с гемоглобином. N-нитроанилид-L-лейцин служил специфическим субстратом при оп-ределении активности лейцинаминопептидазы. Активность карбоксипептидазы определяли по специфическому суб-страту динитрофенил-Lглицил-L-глицил-L-аргинину (DNP-Gly-Gly-Arg).
Экзо--глюканазная активность Метод основан на определении восстанавливающих сахаров, образующихся при действии фермента на зерновой -глюкан.
Ксиланазная активность Определение ксиланазной активности основано на способности фермента расщеплять ксилан с образованием восстанавливающих сахаров.
Целлюлазная активность Активность комплекса целлюлаз определялась по гидролизу фильтровальной бумаги (АФБ), КМЦ и целлюлозы. Влияние температуры и рН на общую протеолитическую активность фер-ментного препарата определяли по результатам его воздействия на 2%-ный раствор гемоглобина при различных температурах и рН. Аналогично определяли оптимум рН и температуры действия -амилазы. В качестве субстрата использовали 1%-ный раствор крахмала. Исследования по содержанию аминокислот, образующихся в результате ферментолиза зернового и картофельного сырья, проводили на ячменном и картофельном сусле и ячменной болтушке. Концентрацию общих и свободных аминокислот определяли по методу Мура и Штейна (9) на аминокислотном анализаторе LG 200 фирмы «Biotronik» (Германия); просчет аминограмм осуществляли методом сравнения площадей стандарта и образца. Исследования по разжижению, осахариванию и сбраживанию зернового сырья проводили по методу постановки бродильных проб. В качестве субстрата использовали пшеницу, ячмень и рожь - как наиболее широко применяемые в спиртовой промышленности. Был исследован качественный состав используемого в экспериментальной работе сырья, содержание в нем основных высокомолекулярных полимеров (10). Модельные опыты проводили по аналогии с технологическими схемами подготовки сырья с развариванием под давлением и по схеме механико-ферментативной обработки, где ведут гидродинамический и ферментативный гидролиз водно-мучной суспензии при температурах до 100°С. Для приготов-ления сусла использовали 20%-ные по сухой массе растворы измельченных ячменя, пшеницы и картофеля, предварительно обработанные при 125°С в течение 1,5 часа (как принято в спиртовом производстве). Ячменную болтушку готовили без предварительной термообработки. Исследовали влияние ферментных препаратов различного спектра действия, используемых при ферментативном гидролизе высокомолекулярных полимеров зернового сырья, на эффективность сбраживания зернового сусла и состав образуемых побочных продуктов брожения. Состав летучих примесей определяли газохроматографическим методом на газовом хроматографе HP «Agilent» 6850 (11-12). В спиртовой промышленности, перерабатывающей крахмалистое сырье, широко применяются ферменты гидролитического расщепления крахмала. Для этой цели используют зерновой солод и ферментные препараты микробного происхождения. Применяемый в спиртовом производстве зерновой солод осуществляет гидролиз крахмала до сбраживаемых углеводов, является источником азотистого питания дрожжей и при осахаривании крахмалистого сырья производит частичную деструкцию его клеточных стенок и белковых ве-ществ. Однако, при применении солода, из-за ограниченной возможности соз-дания достаточно высокой концентрации ферментов, скорость осахаривания и протеолиза сырья остается низкой, что затрудняет интенсификацию процесса брожения. Эффективная замена солода ферментами микробного происхождения является важной задачей. Опытом работы спиртовых заводов в последние 20 лет показано, что применение ферментных препаратов экономически оправдано: интенсифицируется процесс осахаривания крахмала, повышается степень использования сырья, стабилизируются технологические процессы. Мировой опыт свидетельствует о возрастающих масштабах получения и применения ферментных препаратов как в объемах промышленной продукции (в среднем на 10-12%), так и в развитии научных разработок, направленных на повышение активности продуцентов, полученных с использованием генной инженерии, на применение термофильных микроорганизмов, на создание мультиэнзимных композиций и иммобилизованных ферментов. В настоящее время спиртовая промышленность располагает широким ассортиментом концентрированных ферментных препаратов и новых рас спиртовых дрожжей, технологически устойчивых к повышенным температурам, концентрациям спирта, обладающих осмофильными свойствами. Использование новых рас дрожжей и оптимальных ферментативных систем позволит создать конкурентоспособную технологию производства спирта, обеспечивающую повышение степени гидролиза крахмала зернового сырья, сбраживание концентрированного сусла, интенсификацию процесса спиртового брожения, сокращение потерь спирта и сырья, улучшение качества целевого продукта. На первом этапе исследований проведен анализ концентрированных фер-ментных препаратов отечественного и импортного производства с целью подбора эффективного ферментативного комплекса для рационального и полного использования составных частей зернового сырья. Все ферментные препараты, предназначенные для спиртовой промышлен-ности, можно разделить на три основные группы по специфичности их воздействия на различные высокомолекулярные полимеры зернового сырья. I. Достаточно широко представлены ферментные препараты амилолитического действия, способствующие гидролизу крахмала. К ним относятся ферменты разжижающего, декстринирующего и осахаривающего воздействия на крахмал. Эти ферменты можно условно подразделить на 4 класса: *Бактериальная -амилаза, образующая при гидролизе крахмала декстрины с различной степенью полимеризации. Источниками бактериальной -амилазы являются ферментные препараты: Амилосубтилин (Бердский з-д биопрепаратов), БАН («Новозаймс»), Ликвамил («Энде Индастриал Корпорейшн») и др., с оптимумом действия 60-70°С и рН 5.5-7.0, синтезируемые Bacillus subtilis. Наиболее интересными и перспективными препаратами являются ФП термостабильной -амилазы: Амилолихетерм отечественного производства, Термамил («Новозаймс»), Зимаджунт («Эндэ Индастриал Корпорейшн») и др., получаемые глубинным культивированием бактерий Bacillus licheniformis. Оптимальная температура действия этих ферментов 85- 95°С, оптимум рН - 6.0 - 7.0. *Грибная -амилаза, обладающая эндоамилазной способностью к гидролизу крахмала с образованием растворимых декстринов, олигосахаридов и мальтозы, с оптимумом действия 45-55°С и рН 4.8-5.5. Источники: Амилоризин, Амилопротооризин - отечественного производства, Фунгамил («Новозаймс»), Диазим («Джененкор») и др.; продуцент: Aspergillus oryzae. *Глюкоамилаза, предназначенная для осахаривания частично расщепленных полимеров крахмала с образованием глюкозы. Источники: Глюкаваморин - отечественного производства (Бердский з-д биопрепаратов, Мичуринский экспериментальный з-д, ОАО «Восток»), Сан Супер и Сан Ультра («Новозаймс»), Глюкозим, Конверзим («Эндэ Индустриал Корпорейшн»), и др.; продуценты: Aspergillus awamori или A. niger. *Пуллуланаза, способная гидролизовать внутренние связи в амилопек-тине и предельных декстринах с образованием мальтоолигосахаридов (Глю-козим нью - производства «Эндэ Индустриал Корпорейшн»). II. Ко второй группе ферментов относятся ферменты протеолитического действия, гидролизующие белковые полимеры зерна, которые также подразделяются на классы. *Бактериальные протеиназы, продуцируемые Bacillus subtilis или B.licheniformis (Протосубтилин, Протолихетерм - отечественного производства, Нейтраза и Алкалаза - «Новозаймс», БНЗ - «Эндэ Индустриал Корпорейшн»). Препараты содержат одну или две протеиназы, как правило, нейтральную и щелочную, гидролизующие белки до пептидов. Эти ферменты повышают технологичность сусла, снижают вероятность белкового осаждения, но не обеспечивают дрожжевые клетки легкоусвояемым аминным азотом.
--------- Список литературы 1. Усачев А.М. Состояние и подготовка законопректов алкогольной отрасли //Производство спирта и ликероводочных изделии. 2002. - № 1. -С. 4-5. 2. Поляков В.А., Римарева Л.В., Ксандопуло Г.Б. Перспективные биотехнологнческие процессы для спиртовой промышленности //Производство спирта и ликероводочных изделий. 2002. - № 1. -С. 6-8. 3. Римарева Л.В. Создание микробных ферментных препаратов и их роль в повышении эффективности спиртового производства //Сб.: Научно-технический прогресс в спиртовой, и ликероводочной отрасли промышленности. М., Пищепромиздат. -2001. — С.36-52. 4. Римарева Л.В., Яровенко В.Л., Милюкова Т.Б., Устинников Б.А. Использование протеолитического ферментного препарата из A.oryzae в спиртовом брожении //Прикл. Биохимия и микробиология. - 1993. - 29, №6.-С. 869-876. 5. Иванова Е.Г., Киселева Л.В., Ленец КГ., Петрова Г.А. Влияние гемицел-люлаз на гидролиз некрахмальных полисахаридов //Пиво и напитки. - 2002. - № 2, с. 19-22. 6. Лихтенберг Л. А. Влияние технологаческих приемов на качество спирта //Производство спирта и ликероводочных изделий. - 2001. - № 2, с.28-29. 7. ГОСТ 20264-89. Ферментные препараты. 8. Яровенко В.Л., Войнарский И.Н., Римарева Л.В. Определение протеолитической активности ферментных препаратов для спиртового производства //Спирт. и ликеровод. пр-сть. ЦНИИТЭИ Пищпром. -1977. -№5.-С. 9-12. 9. Moore S., Stein W.H.// J. Biol Chem. 1951. V. 192. № 2. P. 663-671. 10. Рухлядева А.П. Техно-химический контроль спиртового производства. М., Пищевая пр-сть. - 1974. - 355 с. 11. ГОСТ Р 51786-2001. Водка и спирт этиловый из пищевого сырья. Газохроматографический метод определения подлинности. 12. ГОСТ Р 51762- 2001. Водка и спирт этиловый из пищевого сырья. Газохроматографический метод содержания летучих кислот и фурфурола. 13. Белозерский А.Н., Проскуряков Н.И// Практическое руководство по биохи-мии растений. М.: Сов. наука, 1951. С. 130-131. 14. Андреев Н.Р., Ладур Т.А., Филлипова Н.И. Переработка ржи на крахмал. - М.: АгроНИИТЭИПП. -1995. - Вып.1. 15. Фертман ГЛ, Шойхет М.Й. Биохимические основы бродильных произ-водств. //Пищепромиздат. М. —1970. — 240 с. 16. Коновалов С.А. //Биохимия дрожжей. М. Пищевая промышленность. -1980. - 240 с. 17. Римарева Л.В. Биотехнология комплексных препаратов кислых протеаз и их роль в интенсификации технологических процессов в перерабатывающих отраслях АПК. Автореф. Докт. Диссерт. М. – 1997. - 51с. 18. Римарева Л.В., Войнарский И.Н., Устинников Б.А.// Ферментная и спирто-вая пр-сть. -1983. - №2. - С.9. 19. Римарева Л.В., Оверченко М.Б., Игнатова Н.И., Кадиева А.Т., Шелехова Т.М., Веселовская О.В. Рациональный выбор расы спиртовых дрожжей //Производство спирта и ликероводочных изделии. -2001.-№2, с. 19-21. 20. Римарева Л.В., Оверченко М.Б., Гернет А.М.//Пиво и напитки. - 2000. -№1. - С.34. 21. Римарева Л.В.// Произ-во спирта и ликеро-вод. изд. - 2000. - №1. — С.18.
22. Римарева Л.В., Оверченко М.Б., Серба Е.М. Трифонова В.В.// Прикл. биохимия и мкробиол. - 1997. — Т.ЗЗ. - №1. - С. 43. 23. Римарева Л.В., Оверченко М.Б.//С6. «Состояние и перспективы развития биотехнологических процессов в пищевой промышленности». М. Пи-щепромиздат. 2001. С. 93. 24. Римарева Л.В., Оверченко М.Б., Трифонова В.В., Игнатова Н.И. //Производство спирта и ликероводочных изделий. 2001. №1. С. 21 25. Грачева И.М. //Прикладная биохимия и микробиология 1983. Т.19. №1. С.ЗЗ. 26. Римарева Л.В., Макеев Д.М., Устинников Б.А. //Пищевая пром-сть. -1993.-№2.-С.29. 27. Римарева Л.В., Оверченко М.Б. //Ликероводочное производство и ви-ноделие. -2000. - №6. - С.8. 28. Plant A.R., Clemens R.M., Daiel R.M., Morgan H.W. Purification and pre-liminary characterization of an extracellular pullulanase from Thermoanaerobium //Appl. Microbiol. And Biotechnol. 1987. - 26., N5, 427-433. 29. Spreinat A., Antranikian G. Purification and synergistic action of pullulanases and maltohexaose forming -amylase //Starke. -1992. - 44. N8. C.305-312.
